1 引言(Introduction)
随着农村畜禽养殖业从个体散养走向集约化养殖, 畜禽养殖产生的 废物已经成为我国农村环境污染的 主要来源之一.集约化猪场每百头猪每天产生的 废水可高达2~3 m3.据国家环保局统计, 2002年我国畜禽粪便产生量达27.5亿t, 畜禽粪便每年流失至水体的 总氮和总磷分别为87万t和34.5万t.规模化畜禽养殖场产生的 污水通常采用沼气池厌氧发酵处理, 以求资源化利用发酵产生的 沼气.但与此同时产生的 大量沼液中仍然含有高浓度的 氮、磷等营养盐.经过沼气池发酵处理的 猪场沼液具有两大特点：一是氨氮浓度高且是污水中的 主要氮源;二是污水中氮、磷浓度差异大.经对猪场沼液的 周年监测, 发现原始沼液中总氮浓度可高达800 mg·L-1, 氨氮浓度超过700 mg·L-1, 总磷超过3 mg·L-1.将其直接排放到水体中会导致严重的 水体富营养化, 破坏水域生态系统平衡.在2014年最新的 《中华人民共和国环境保护法》颁发及人们对生态环境质量要求提升的 大背景下, 高效的 畜禽粪污无害化处理技术对实现畜禽养殖业的 可持续发展和生态文明具有重要的 意义, 寻找高效的 沼液综合利用技术和沼液无害化处理技术显得尤为急迫.
微藻细胞能以光为能源, 从水体中吸收硝态氮、氨态氮及磷酸盐等营养物质用于合成细胞, 从而降低水体中的 氮磷营养盐.同时, 生成的 微藻细胞又可用于饲料、新能源生产等多种用途.因此, 微藻作为畜禽养殖污水的 生物处理及资源化利用的 载体近来备受关注.已有研究表明, 利用污水中的 氮磷等营养盐培养微藻, 能有效去除污水中的 氮磷营养盐, 实现环境保护及资源的 循环利用.Wang等(2010)将小球藻(Chlorella sp.)接种到厌氧分解后的 牛粪污水中, 经21 d可去除76%~83%的 总氮和63%~75%的 总磷.Zhang等(2008)发现, 固定化栅藻(Scenedesmus sp.)对污水中氮磷的 去除率最高达100%.刘林林等(2014)发现, 狭形小桩藻(Characium angustum)SHOU-F87在猪场养殖污水中可以去除64%的 总氮和96%的 总磷.不同微藻对水体中的 氮磷等营养盐的 耐受、吸收和利用能力不同(刘林林等, 2014).当营养盐水平足以满足浮游植物生长时, 浮游植物对氮磷的 吸收基本按照Redfield比例(N:P=
16:1) 进行(Redfield, 1958).而猪场养殖污水经厌氧发酵后形成的 沼液中, 氮磷浓度极度不平衡, 尤其是氨态氮浓度高, 而总磷浓度低.极高的 氮磷比远远偏离藻类生长的 正常需求, 不符合微藻的 最适生长条件.尽管利用微藻净化污水的 研究已有大量报道, 但在污水中补充限制性磷盐以提高微藻生长及营养盐的 吸收效率的 研究尚少.本试验所用绿球藻(Chlorococcum sp.)是一株从猪场养殖污水中分离出的 藻株, 对污水环境适应性强.穆亮亮等(2016)研究发现, 此株绿球藻具有耐高温的 特性, 在培养温度为35 ℃时, 藻细胞密度（单位:g/cm3或kg/m3)和油脂含量最高, 且可以耐受40 ℃高温.
因此, 本文通过研究该株绿球藻在添加不同浓度磷的 污水中生长及净化污水的 特点, 以期寻找到绿球藻在污水中生长较好且筛除氮、磷效率比较高的 最适氮磷比.
2 材料和方法(Materials and methods)2.1 试验材料2.1.1 藻种来源
试验藻株分离自浙江嘉兴余新镇敦好农牧有限公司露天沼液存贮池, 在实验室进行纯化并逐级扩大培养后用于本试验, 该藻种经显微镜鉴定为绿球藻属(Chlorococcum sp.).
2.1.2 试验污水
试验用沼液取自上海市光明集团明锦畜牧有限公司的 养猪场, 沼液经沉淀（precipitation）处理后, 再经500目筛网过滤, 并用自来水稀释(dilute)至氨氮浓度约为300 mg·L-1后用于本试验.
2.2 试验方法
在氨氮浓度约为300 mg·L-1的 污水中, 添加不同量的 NaH2PO4以调节污水N:P配制成可溶性氮、磷物质的 量浓度比分别为
8:1、
16:1、3
2:1和6
4:1的 系列污水, 以不添加NaH2PO4的 原污水作为对照组(N:P比约为53
2:1).各组水质指标如表 1所示.将预先扩大培养的 绿球藻离心收集藻细胞, 然后将收集的 藻细胞分别接种到装有1000 mL不同氮磷比污水的 锥形瓶中, 初始接种密度为400×104 cells·mL-1, 每组设置3个平行.将绿球藻置于光照培养箱中进行培养, 温度35 ℃, 光照3000 lx, 光照周期为24 L:0 D(24 h光照, 0 h黑暗).每天定时摇瓶3次, 隔天用血球计数板计数藻细胞密度, 每隔2 d测定培养水体中氮、磷变化情况.试验进行12 d, 实验结束时收集藻细胞测量生物量干重.
表 1 试验用污水的 水质指标状况
2.3 指标检测
采用血球计数板测定藻细胞密度, 并采用式
(1) 计算相对生长率K(成永旭, 2005).
(1)
式中, N0为培养初始藻细胞密度(cells·mL-1), Nt为培养t天后的 藻细胞密度(cells·mL-1), t为培养时间(d).
培养水体经0。聚丙烯酰胺为使污水达到排入某一水体或再次使用的水质要求对其进行净化的过程。45 μm微孔滤膜抽滤后进行检测, 参照《水和废水监测分析方法(第4版)》(国家环境保护总局, 2002)测定水样中氮、磷水平.其中, 氨态氮测定采用纳氏试剂分光光度法;硝态氮测定采用紫外分光光度法;总氮测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法;总磷测定采用钼酸铵分光光度法.
氮、磷去除率r的 计算见式
(2)(刘林林等, 2014).
(2)
式中, C0和Ct分别为初始氮、磷的 浓度和培养t天后的 浓度(mg·L-1).
培养结束后, 每组取80 mL藻液经预先恒重过的 0.45 μm微孔滤膜抽滤, 将滤膜置于鼓风干燥箱中105 ℃烘至恒重, 计算生物量干重B (穆亮亮, 2016)：
(3)
式中, W0为预恒重过的 0.45 μm微孔滤膜的 质量(g), W1为恒重过后0.45 μm微孔滤膜+藻泥的 总质量(g), V为抽滤的 藻液体积(L).
2.4 数据处理与分析
结果以平均值±标准差表示, 采用PASW Statistics 18.0软件进行单因素方差分析和Duncan多重比较, 以 p<0.05表示差异显著.
3 结果(Results)3.1 绿球藻在不同氮磷比污水中的 生长状况
不同氮磷比污水中绿球藻生长曲线如图 1所示.由图可知, 前6 d为指数生长期, 之后各组藻细胞密度趋于平缓后开始下降.在培养8 d后, N:P为
8:1、
16:1、3
2:1、6
4:1处理组和对照组藻的 相对生长率分别为0.248、0.256、0.261、0.279和0.244.N:P为6
4:1组的 绿球藻生长最好, 在第8 d时藻细胞密度最高为3646×104 cells·mL-1, 第12 d时细胞密度为3393×104 cells·mL-1, 均显著高于其他组(p < 0.05);其次为3
2:1和
16:1组, 对照组的 细胞密度最低.
图 1绿球藻在不同氮磷比污水中的 生长曲线
培养12 d后, 不同氮磷比污水中绿球藻的 生物量干重如图 2所示, N:P=6
4:1组藻生物量(以干重计)最高(0.49 g·L-1), 其次为3
2:1和
16:1组, 均显著高于对照组(p < 0.05).
图 2绿球藻在不同氮磷比污水中的 生物量(不同小写字母表示不同实验组之间存在显著差异(p<0.05))
3.2 不同氮磷比对绿球藻去除污水氨态氮的 影响
培养12 d后, 各处理组的 绿球藻对猪场污水的 氨态氮去除率均较高, 达70%以上(图 3).N:P为6
4:1组对氨态氮的 去除率达到最高, 为74.94%, 氨态氮浓度从291.31 mg·L-1降低至73.01 mg·L-1;其次是3
2:1、
16:1和
8:1组, 去除率分别为73.71%、73.40%和71.44%, 均显著（striking）高于对照组(p < 0.05).对照组对氨态氮的 去除率最低(68.79%), 氨态氮浓度从291.31 mg·L-1降低至90.91 mg·L-1.
图 3不同氮磷比污水对绿球藻去除氨态氮的 影响
3.3 不同氮磷比对污水中硝态氮浓度的 影响
培养过程中, 各处理组水体中的 硝态氮浓度呈升高趋势（trend)(图 4).培养12 d后, N:P为6
4:1组的 硝态氮浓度最高, 从13.31 mg·L-1增加至48.66 mg·L-1, 其次是3
2:1和
16:1组, 均显著高于对照组(p < 0.05).对照组硝态氮增加量最低, 从13.31 mg·L-1增加至38.21 mg·L-1.
图 4不同氮磷比对污水中硝态氮浓度的 影响
3.4 不同氮磷比污水对绿球藻去除总氮的 影响
由图 5可知, 初始水体中总氮浓度为290.84 mg·L-1, 试验结束时, N:P为6
4:1组的 总氮去除率最高, 水体中总氮浓度降低至148.96 mg·L-1, 总氮去除率为48.8%.其次为3
2:1和
16:1组, 且三者之间无显著差异(p>0.05), 但均显著高于对照组(p < 0.05).对照组的 总氮去除率最低, 为42.71%, 培养结束时水体中总氮浓度为166.61 mg·L-1.
图 5不同氮磷比污水对绿球藻去除总氮的 影响
3.5 不同氮磷比污水对绿球藻去除总磷的 影响
不同处理组水体中总磷浓度的 变化如图 6所示, 各处理组的 总磷去除率随N:P增大而增大.总磷去除率最高的 为对照组, 达到82.74%, 其次为6
4:1组, 去除率为71.86%.试验结束时, N:P为6
4:1和对照组污水中总磷浓度分别为3.07和0.22 mg·L-1.N:P为
8:1组的 总磷去除率最低, 仅为33.62%.
图 6不同氮磷比污水对绿球藻去除总磷的 影响
4 讨论(Discussion)
氮是微藻生长过程中一种重要的 营养素, 主要用于合成细胞内蛋白质及其他具有生理活性的 含氮化合物.微藻可以利用多种形式的 氮源, 但微藻生长状态与氮源的 形式和数量有密切联系.通常情况下绿藻类会优先利用氨态氮, 直到耗尽后才开始利用硝态氮.因此, 选择绿藻门的 微藻可以较好地适应畜禽养殖污水的 特点, 利用氨态氮作为其生长的 氮源, 从而达到净化污水的 目的 .然而, 高浓度的 氨氮对微藻生长具有抑制作用, 微藻能够耐受的 氨态氮浓度随着藻种的 不同存在差异.本试验采用的 绿球藻, 正是一株从猪场污水中筛选出的 绿藻藻株, 相比天然水体中分离的 微藻, 其对高氨氮污水的 适应性更强.
磷是微藻合成磷脂、核酸、核苷酸等物质的 重要元素, 是微藻生长必需的 基本营养素.微藻对磷的 吸收有2种用途, 一是合成细胞内物质, 如磷脂等;另一种被称为“奢侈消费”(luxury uptake), 即微藻吸收过量的 磷并以无机多磷酸盐形式贮存，当外界磷浓度受限制时, 藻细胞内贮存的 磷酸盐则可被利用.因此, 当微藻进入在一个相对缺磷的 培养体系中, 微藻仍然可以利用先前贮存的 磷源实现一定的 生长.
本研究中, 在初始氨氮浓度为291.31 mg·L-1的 条件下, 无论是否添加磷源, 各组污水中的 绿球藻都表现出良好的 生长性能, 其中, N:P为6
4:1组在第8 d时具有最大的 细胞密度, 从最初的 400×104 cells·mL-1上升到3646×104 cells·mL-1, 相对生长率达0。聚丙烯酰胺污水处理被广泛应用于建筑、农业、交通、能源、石化、环保、城市景观、医疗、餐饮等各个领域，也越来越多地走进寻常百姓的日常生活。279, 12 d时生物量达0.49 g·L-1.刘林林等(2014)研究了狭形小桩藻在猪场污水中的 生长性能, 其最高相对生长率为0.120.严佳琪等(2012)研究了5种淡水微藻在f/2培养基条件下的 生长性能, 其中, 绿球藻SHOU-F3的 最高相对生长率K为0.21.对比上述研究与本试验结果发现, 本研究所用绿球藻在猪场沼液中的 相对生长率较高, 表明此株绿球藻在高氨氮浓度污水中生长较好, 且污水的 N:P比值对耐污绿球藻的 生长产生了显著影响.培养液中N:P影响微藻生长已在多种微藻中得到证实.刘皓等(2010)用不同氮磷比培养液培养中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii), 结果发现, N:P为6
4:1组的 生长率和细胞数量最高.Rhee(1978)发现, 栅藻(Scenedesmus sp.)在不受任何营养物质限制的 情况下, 所需N:P为30:1.Li等(2010)报道了栅藻(Scenedesmus sp.)的 最适氮磷比是
5:1~
8:1.Kim等(2013)认为微藻生长最适的 氮磷比取决于氮源种类.尽管Stumn提出藻类的 “经验分子式”为C106H181O45N16P, 但藻细胞组成会受藻种不同及培养条件等因素影响, 不同藻种代谢途径有差异, 因此,
16:1并不是所有藻株最适的 氮磷比(Arbib et al., 2013).本研究中, 绿球藻在污水中生长的 最适氮磷比为6
4:1, 也远远大于Redfield比值(N:P=
16:1).这可能与该藻株分离自猪场污水有关.猪场污水中氮相对于磷显著偏高, 推测该株绿球藻已经适应了在高氨氮浓度及高氮磷比条件并生长存活.这也进一步暗示通过适当的 诱导驯化, 可以提升微藻适应高氨氮浓度及高氮磷比的 能力.
培养液氮磷比值不但影响绿球藻的 生长, 还影响绿球藻对污水中氮、磷的 吸收净化效果.本研究发现, N:P约为53
2:1的 原污水中绿球藻生长和去除氮效果最差, 添加NaH2PO4调整N:P后, 各组绿球藻的 生长和去除氮效果均有改善.绿球藻在N:P为6
4:1的 污水中生长最好, 且对氨态氮、总氮去除率高达74.94%和48.78%, 氨氮的 浓度降至73.01 mg·L-1, 基本达到集约化畜禽养殖业水污染物最高允许日均排放浓度限定的 70 mg·L-1 (浙江省环境保护局等, 2005).说明在猪场养殖污水中磷不足条件下, 绿球藻对氮的 吸收受到限制, 补充磷源后, 绿球藻的 细胞密度和对氮的 去除效果明显提高.Martineza等(2014)也发现在培养微藻的 无磷培养液中添加磷源后, 藻细胞内磷浓度和培养液中氨态氮的 去除率显著增加.Wang和Lan(2011)发现, 富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)对污水中氮的 去除受N:P影响显著, 而磷的 去除对N:P不敏感.Beuckels等(2015)的 研究结果表明, 氮浓度对磷的 去除率有积极影响, 磷的 高效去除需要高浓度的 氮.这为以后提高猪场养殖污水中氮的 去除效率提供了有力依据.
对照污水中绿球藻的 生长曲线和污水中氨态氮、总氮和硝态氮的 去除曲线, 可以发现, 在绿球藻快速生长的 前6 d, 污水中的 氨态氮也呈快速下降的 趋势, 且各组间的 氨态氮去除率随微藻的 相对生长率增大而增大, 表明微藻的 快速生长是引起污水中氮、磷浓度下降的 主要原因.然而, 在此期间, 硝态氮没有被利用, 反而浓度略升高.一方面, 可能是猪场养殖污水中存在硝化细菌, 硝化细菌将部分氨态氮转化成硝态氮所致.另一方面, 也可能是微藻快速生长过程中光合作用产生的 氧, 加速了部分氨态氮氧化（oxidation)成硝态氮所致.培养期间, 藻细胞生长的 同时, 氨态氮、总氮和总磷浓度下降而硝态氮浓度上升的 现象也证明了该株绿球藻优先利用氨态氮的 特点.
然而, 对照污水中绿球藻的 生长曲线和污水中总磷的 吸收曲线, 尽管在绿球藻快速生长的 前6 d, 污水中的 总磷也呈快速下降的 趋势, 但各组总磷的 去除率并不与各组绿球藻的 相对生长率存在正相关, 初始总磷水平越低, 总磷的 去除率越高.N:P为
8:1组的 初始磷浓度最高(87.62 mg·L-1), 前6 d对磷的 去除率为30.08%, 而对照组初始磷浓度最低(1.27 mg·L-1), 前6 d的 磷去除率高达82.74%, 但高磷水平组总磷的 绝对去除量更高, 此结果也证明了微藻对磷的 “奢侈消费”现象.N:P为6
4:1组在绿球藻培养12 d时的 总磷去除率达71.86%, 总磷浓度降低为3.07 mg·L-1, 低于集约化畜禽养殖业水总磷最高允许日均排放浓度限定的 7 mg·L-1 (浙江省环境保护局等, 2005).然而, 通过添加磷源以提高微藻对猪场废水的 净化效率会增加处理成本, 从现实应用的 角度, 还需考虑其经济性能.具体参见污水宝商城资料或更多相关技术文档。
5 结论(Conclusions)
污水中氮磷比值影响绿球藻生长及其对污水中氮、磷的 净化效果, 在初始氨氮浓度为291.31 mg·L-1的 猪场养殖污水中, 通过添加NaH2PO4以调节污水N:P为6
4:1, 接种绿球藻(Chlorococcum sp.)培养12 d后, 可使污水中的 氨态氮和总磷分别降低到73.01 mg·L-1和3.07 mg·L-1, 基本达到相关排放标准.
